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    行業新聞

    2020-07-28紫草素及其衍生物抗婦科腫瘤作用研究進展

     要:紫草素是從傳統中藥紫草中提取的萘醌類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、促進傷口愈合等作用。近年來,紫草素及其衍生物的抗腫瘤作用得到廣泛研究。多項體外和體內研究表明紫草素及其衍生物可有效抑制乳腺癌、宮頸癌等婦科惡性腫瘤的發生與發展。從阻滯細胞周期、促進腫瘤細胞凋亡、抑制癌細胞轉移和侵襲、誘導自噬和壞死等方面綜述近幾年紫草素及衍生物在抗婦科腫瘤領域的研究進展,為紫草素類化合物在婦科腫瘤中的臨床研究提供參考。

     

     

    紫草為臨床常用中藥,最初記載于《神農本草經》,味苦、性寒,有涼血、活血、解毒等功能,可用于體表清熱、內服解毒、局部傷口活血化瘀[1]。多項研究發現紫草還有顯著的抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤的藥理作用[2]。紫草的活性成分主要是提取于其干燥根部的萘醌類(naphthoquinone)色素,較為常見及研究較多的包括硬紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb. etZucc. 的主要成分紫草素(右旋紫草素,shikonin,1,圖1);新疆軟紫草Arnebia euchroma Johnst的主要成分阿卡寧(左旋紫草素,alkannin,2,圖1),為紫草素的對映異構體[3];還有從內蒙紫草Arebia guttata Bunge中提取的異戊酰紫草素(isovaleryl shikonin[4],其他紫草素天然衍生物如乙酰紫草素、去氧紫草素、異丁酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰紫草素和Beta,beta-二甲基丙烯酰紫草素等[5]。

    近年來,紫草素的藥理活性尤其是抗腫瘤作用得到廣泛研究[6-7]。為降低其對正常細胞的毒性和提高抑癌效率,研究者對紫草素的結構進行了改造,其分子結構中可供修飾的位點主要包括母核萘茜環、含有6個碳原子的側鏈及側鏈上羥基,從而得到了多種不同的合成衍生物[8-9],如2-二硫代氨基甲酸酯- 3-甲基取代類萘醌化合物、側鏈羥基經改造產生的香豆素-羧基紫草酸酯衍生物PMMB229-240、1,4-二肟-5,8-二甲氧基萘、芳基二氫噻唑?;喜菟仵パ苌锏?,且研究了它們對癌細胞和正常細胞的毒性,結果顯示紫草素合成衍生物具有更良好的應用前景?,F就紫草素及其衍生物對4種常見的婦科惡性腫瘤乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌及子宮內膜癌的抗腫瘤效應和作用機制進行綜述。

     

    1  紫草素抗婦科腫瘤作用研究

    1.1  抗乳腺癌

    Chen[10]研究紫草素、乙酰紫草素和β,β-二甲基丙烯酰紫草素對人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞和小鼠乳腺癌4T1細胞的毒性作用發現,紫草素對4T1細胞生長有明顯抑制作用。紫草素處理72 h4T1細胞半數抑制濃度(IC50)為(0.83±0.03μmol/L,對MDA-MB-231細胞的IC50為(1.13±0.06μmol/L,而對正常乳腺上皮細胞毒性較弱,IC50為(3.76±0.09μmol/L。乳腺癌肺轉移模型小鼠連續給予紫草素(10 mg/kg14 d后,治療組小鼠肺轉移結節總數明顯少于對照組,結節體積較小,肺轉移灶面積也明顯減小。結果表明紫草素可抑制乳腺癌細胞肺轉移。

    Yang[11]發現人乳腺癌SK-BR-3細胞經不同濃度的紫草素處理48 h后增殖速率降低,凋亡率升高,且具有濃度依賴性,其中紫草素1 μmol/L處理組細胞增殖率為(24±4%,凋亡率為11.6%,與對照組比較差異顯著。此外,紫草素0.1、1、10 μmol/L處理人乳腺癌MCF-7細胞24 h[12],隨紫草素濃度升高,細胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高。以上結果表明紫草素能劑量依賴性地抑制乳腺癌細胞的生長。

    1.2  抗宮頸癌

    用紫草素衍生物β-羥基異戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin,β-HIVS1、5、10 μmol/L處理人宮頸癌HeLa細胞不同時間后[13],結果表明,β-HIVS呈時間和劑量依賴性地抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,同時細胞周期分布也發生明顯改變,G0/G1期細胞數減少,S期細胞數增加,而G2/M期細胞數無明顯變化,證明β-HIVS能將宮頸癌細胞的細胞周期阻滯在S期。Lin[14]將丙酮酸脫氫酶(PDH)的輔助因子α-硫辛酸引入紫草素中,合成具抗有絲分裂和糖酵解的雙效化合物,得到18α-硫辛酸紫草素酯衍生物,其中化合物1C(圖2)對HeLa細胞具有最強的細胞毒性,IC50值為(3.14±0.58μmol/L。一方面其作為微管蛋白抑制劑在G2/M期引起HeLa細胞周期阻滯。HeLa細胞移植瘤小鼠經不同劑量(0.52.0 mg/kg1C處理后,腫瘤體積均小于對照組,其中2 mg/kg處理組小鼠平均腫瘤體積比對照組小5倍,表明1C以劑量依賴方式抑制異種移植腫瘤生長,但不影響小鼠體質量。另一方面其通過磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)活性的抑制促進了PDH活性,迫使HeLa細胞更多地進行好氧代謝,誘發其凋亡。

    紫草素作用于體外培養的人宮頸癌SiHa細胞后[15],細胞增殖指數下降,G0/G1期細胞增多,S期細胞減少,且呈濃度依賴性,證明紫草素能夠阻滯SiHa細胞的G0/G1期進程而抑制細胞增殖。紫草素處理人宮頸癌Caski細胞12、24、36 h[16]發現細胞增殖抑制率逐漸升高,侵襲數量降低,磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)表達量升高,并呈時間和劑量依賴性。說明紫草素可抑制宮頸癌細胞增殖和侵襲過程。

    1.3  抗卵巢癌

    人卵巢癌細胞SKOV3A2780經紫草素(5、10 μmol/L)處理后[17],與對照組比較,凋亡率無明顯變化,但細胞中壞死性凋亡相關蛋白水平均明顯上調,壞死細胞比例明顯增加。說明紫草素以劑量和時間依賴性地抑制卵巢癌細胞增殖并誘導其發生壞死性凋亡,而對人正常卵巢上皮IOSE-80細胞的影響很小。

    紫草素可明顯逆轉人卵巢癌順鉑耐藥細胞SKOV3/DDP的耐藥性,且在順鉑濃度為12.5 μmol/L時效果較為顯著,化療聯合使用紫草素可顯著抑制癌細胞周期G1/S轉化,對比單用順鉑組,紫草素和順鉑聯用組的細胞早期凋亡率上升[18]。P-糖蛋白(P-gp)是一種能量依賴性跨膜轉運蛋白,常作為腫瘤多藥耐藥性(MDR)的標志物。紫草素1 μmol/L、紫杉醇1 μmol/L單獨使用或聯合使用處理人卵巢癌耐藥細胞A2780/PTX 24 h可明顯誘導癌細胞凋亡,凋亡率分別為6.3%、10.6%30.9%,進一步研究發現紫草素以不依賴P-gp蛋白的方式逆轉A2780/PTX細胞對紫杉醇的耐藥性[19]。這暗示紫草素與其他抗癌藥物聯合使用可能為治療卵巢癌及其他癌癥提供新的治療策略。

    1.4  抗子宮內膜癌

    子宮內膜癌中有70%80%為雌激素依賴型,孕激素治療是主要的內分泌治療措施,但超過30%的早期患者對孕激素不敏感[20-21]。雌激素對雌激素受體陽性的人子宮內膜癌Ishikawa細胞有促進增殖作用,但在含有10 nmol/L雌激素的培養液中逐漸增加紫草素濃度,細胞增殖抑制率顯著升高,且具有濃度和時間依賴性[22]。另外用不同濃度的紫草素分別處理4種人子宮內膜癌細胞Ishikawa、HEC-1A、KLERL95-2 24 h,發現紫草素以劑量依賴的方式降低癌細胞活力,對4種細胞的IC50分別為3.63、4.81、8.22、8.96 μmol/L。IshikawaHEC-1A細胞對紫草素更為敏感,經紫草素5 μmol/L處理24 h后,細胞凋亡率均明顯增加[23]。紫草素可抑制人子宮內膜癌RL95-2細胞的增殖并促進其凋亡[24],具有劑量和時間依賴性,其中1.2 μg/mL促凋亡效果最佳,細胞凋亡率為(29.57±3.24%。以上結果提示紫草素對不同子宮內膜癌細胞具有不同程度的促凋亡作用,且具有濃度和時間依賴性,其中對Ishikawa細胞的抑制生長和促凋亡活性更強。

    2  紫草素抗婦科腫瘤的作用機制

    2.1  抑制腫瘤細胞增殖

    惡性增殖是癌細胞最顯著的特征,大量實驗表明紫草素可通過多個靶標分子和信號通路抑制腫瘤細胞增殖。有研究發現[25]紫草素能夠在mRNA和蛋白水平誘導雙特異性磷酸酶(DUSP1)和DUSP2的表達,降低其下游信號分子c-jun N端激酶(JNK)和p38的活性,阻滯細胞周期中的G1期,進而抑制MCF-7、MDA-MB-231SK-BR-3細胞增殖。多項研究[15,18,20]發現不同濃度紫草素作用于SiHa、SKOV3/DDP、Ishikawa細胞后,G0/G1期細胞比例顯著增高,G2/M期細胞比例顯著降低,S期細胞比例降低,其作用機制與G蛋白偶聯雌激素受體(GPER)、細胞周期蛋白D1Cyclin D1)、細胞周期依賴性蛋白激酶2CDK2)等蛋白表達水平下調有關。

    細胞分裂周期蛋白25Cdc25)通過調節其底物CDK的磷酸化狀態,在細胞周期進程中起著至關重要的作用。紫草素能夠抑制Cdc25磷酸酶活性,濃度依賴性地抑制CDK1去磷酸化,從而抑制MCF-7HeLa細胞增殖,體內實驗證明紫草素1、5、10 mg/kg對異種移植腫瘤模型小鼠有良好的抗癌細胞增殖作用,阻滯細胞于G2/M[26]。

    來源于MCF-7細胞的外泌小體可以被腫瘤細胞本身吸收,從微環境中快速獲得的miR-128外泌體能下調促凋亡基因Bax,保護癌細胞免受程序性死亡,并通過miR-128的傳遞促進MCF-7細胞增殖。qRT-PCR法檢測發現經紫草素1 μmol/L處理的MCF-7細胞miR-128外泌體釋放減少,提示紫草素可以通過改變腫瘤微環境來抑制腫瘤增殖[27]。

    2.2  誘導腫瘤細胞凋亡

    細胞凋亡是從體內去除衰老細胞的自然途徑,然而癌細胞中凋亡信號失調和抗凋亡系統的激活允許癌細胞逃避凋亡程序,不受控制地增殖從而導致腫瘤存活。許多抗癌療法通過誘導細胞凋亡及其相關的細胞死亡網絡而起作用,紫草素也不例外。

    紫草素對4T1MDA-MB-231細胞的凋亡均有誘導作用。經2 μmol/L紫草素處理后,4T1細胞中p38、JNK及磷酸化JNK蛋白水平與對照組差異不明顯,磷酸化p38蛋白表達水平升高,提示紫草素是通過激活p38信號通路而非JNK信號通路,提高Caspase-3/7蛋白表達水平,誘導4T1細胞凋亡[28]。紫草素9 μmol/L可使人卵巢癌耐順鉑細胞A2780-CR的存活率降低50%,呈時間依賴性地升高JNK、促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和胞外信號調節激酶(ERK)的磷酸化水平,表明紫草素可通過激活MAPK信號通路誘導A2780-CR細胞凋亡。同時發現紫草素能降低卵巢癌細胞內Bcl-2水平,提高Bax、Caspase-9Caspase-3的水平,降低線粒體膜電位(Δψm),升高從線粒體釋放到胞漿的細胞色素C水平,提示紫草素通過線粒體依賴途徑誘導癌細胞凋亡[29]。

    實體腫瘤具有非常獨特的生理特征,如血管異常和瘤內缺氧。為了防止氧耗竭導致的細胞死亡,癌細胞往往高表達低氧誘導因子(HIF-1α)。人工合成的香豆素-羧基紫草酸酯衍生物PMMB232能夠劑量依賴性地促進HeLa細胞凋亡,凋亡細胞比例為38.0%,明顯高于紫草素處理組的凋亡細胞比例(20.8%)。PMMB2328 μmol/L處理HeLa細胞后HIF-1α表達顯著降低,與相同濃度的紫草素處理組結果相似,分子對接計算發現PMMB232能與HIF-1α穩定結合,促進HIF-1α的降解而誘導腫瘤細胞凋亡[30]。

    磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K/蛋白激酶BAkt/哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR/PTEN通路在多種癌癥中被激活,在抑制細胞凋亡和促進增殖方面起著關鍵作用,是一條相對獨立且復雜的途徑,與HIF-1α等多種途徑也密切相關。紫草素通過抑制原癌基因miR-106b在子宮內膜癌細胞HEC-1A、KLERL95-2中的表達來上調抑癌基因PTEN,上調的PTEN可拮抗PI3K信號轉導,抑制Akt/mTOR通路從而促進細胞凋亡,而miR-106的過表達則顯著減弱紫草素誘導的細胞凋亡[23]。

    2.3  抑制癌細胞侵襲和轉移

    控制癌細胞侵襲和腫瘤轉移對于改善癌癥患者的預后具有重要意義。紫草素可通過上調糖原合成酶激酶GSK-3β)水平而增強β-連環蛋白(β-catenin)的磷酸化,減少β-catenin的表達與核積累,抑制其與T細胞因子(TCF)的結合,從而抑制上皮間質轉換(EMT)相關基因的轉錄,下調間質標記物N-鈣粘蛋白表達,降低波形蛋白和Snail蛋白水平,升高上皮標記物E-鈣粘蛋白水平,表明紫草素通過抑制Wnt/β-catenin信號通路逆轉MDA-MB-2314T1細胞的EMT,從而抑制乳腺癌細胞轉移和侵襲[10]。紫草素9 μmol/L處理A2780-CR細胞48 h[29]檢測發現E-鈣粘素水平升高,N-鈣粘素水平降低,表明紫草素也能逆轉卵巢癌細胞EMT從而減弱其遷移能力。

    紫草素衍生物PMMB232處理的HeLa細胞[30]HIF-1α的表達量比對照組下降了3倍,同時E-鈣粘蛋白表達顯著上調,細胞間黏附力加強,腫瘤細胞遷移和轉移減慢,表明紫草素通過下調HIF-1α表達而抑制癌細胞侵襲和轉移。

    另有研究發現紫草素以劑量依賴性的方式有效地抑制信號傳導及轉錄激活蛋白3STAT3)的激活和表達,并抑制局部黏著斑激酶(FAK)的活性和Src的表達來阻礙MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-74T1細胞的侵襲性生長和轉移[31]。

    2.4  誘導壞死、自噬和細胞免疫

    與凋亡不同的是,壞死是一種不依賴Caspase的非程序性細胞死亡,主要受受體相互作用絲氨酸蛋白激酶1RIP1)和RIP3的調控,也與細胞內活性氧(ROS)含量相關,ROS升高引起嚴重的DNA損傷和基因突變及腫瘤細胞的活性炎癥,對于腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和血管生成具有促進作用[32]。

    紫草素能夠促進MDA-MB-468細胞內腫瘤壞死因子TNF-α)與腫瘤壞死因子α受體1TNFR1)結合,刺激細胞質膜上形成死亡復合物I(包括TRADD、TRAF2、RIP1KCIAP1)。被Necrostatin-1阻斷的壞死復合物IIb的形成需要RIP1K的激酶活性,紫草素使細胞質內ROS含量上升,提高RIP1K、RIP3K和混合系列蛋白激酶樣結構域(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)的磷酸化水平,導致這3種蛋白相互作用介導的壞死復合物IIb形成,進而增加線粒體ROS的產生,降低Δψm,導致腫瘤細胞壞死[33]。使用DCFH-DA熒光探針檢測發現紫草素處理后的SKOV3A2780細胞內ROS水平顯著升高,說明紫草素通過促進卵巢癌細胞中ROS過量積累而激活壞死性凋亡進程[17]。

    免疫原細胞死亡(ICD)一般通過釋放損傷相關分子模式(DAMPs)介導,宏觀自噬活性增強通常伴隨著壞死的發生[34]。用紫草素處理小鼠乳腺癌4T1-luc2細胞,引發RIPK1RIPK3依賴性壞死[35-36],伴隨著細胞自噬增強引起膜表面DAMPectoDAMP)上調,從而激活共培養樹突狀細胞(DCs),以抑制原發性癌細胞轉移,用紫草素和氯喹聯合處理4T1-luc2細胞比單用紫草素更能增強免疫原活性和基于DCs的癌癥疫苗效應。

    2.5  抑制糖酵解

    腫瘤通常利用糖酵解為自身代謝和生長提供能量,即Warburg效應,丙酮酸激酶M2PKM2)不僅是控制糖酵解最后一步的限速酶[37],也是癌細胞調節基因表達的蛋白激酶[38]。被表皮生長因子受體(EGFR)激活后的PKM2從細胞質轉移到細胞核,激活β-catenin,誘導編碼周期蛋白D1的基因(CCND1和癌基因c-Myc表達,上調葡萄糖轉運體1GLUT1)和乳酸脫氫酶ALDHA)水平,增加了葡萄糖的消耗和乳酸的產生,進而促進了腫瘤的發生[39]。

    紫草素可以抑制MCF-7細胞中的丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶-1、雙磷酸果糖醛縮酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的活性,從而降低癌細胞的糖酵解率[40]。1 μmol/L紫草素處理24 hMCF-7MDA-MB-231細胞中PKM2活性下降,HIF-1α和血管內皮生長因子(VEGF)表達量減少,細胞遷移能力降低,提示紫草素可以通過靶向PKM2/ HIF-1α軸來抑制乳腺癌細胞的遷移[41]。此外紫草素也能劑量依賴性地抑制SKOV3CP70細胞內PKM2的活性[42],顯著減少癌細胞對葡萄糖消耗,降低胞外酸化率,從而引起卵巢癌細胞代謝紊亂和抑制其惡性表型。研究者設計出一系列新型萘醌衍生物[43],其中哌啶基替代化合物3K具有比紫草素更強的抑制PKM2活性的能力,其IC50為(2.95±0.53μmol/L,而紫草素對PKM2IC50為(8.82±2.62μmol/L;3K也具有更強的抑制HeLa細胞增殖的能力,IC50為(0.29±0.11μmol/L,紫草素對HeLa細胞的IC50為(2.45±0.81μmol/L。

    3  結語

    國內外大量研究發現紫草素可通過多條信號通路和多個分子靶點(如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt/ mTOR/PTEN、p38-MAPK、Bcl-2/Bax、ROS/HIF-1α、STAT3、RIPK1/RIPK3PKM2等)抑制婦科腫瘤的多種細胞增殖、侵襲和轉移,誘導癌細胞凋亡、壞死和自噬,從而發揮抗腫瘤效應。

    盡管多項體外實驗和體內動物實驗已經證實了紫草素的抗腫瘤作用和機制,但還沒有紫草素或其衍生物作為抗腫瘤藥物獨立應用于臨床,通常都是伴隨化療藥物,相互作用以增強抗癌效果[18-19]。限制因素主要有紫草素有效濃度相對較高,且可能存在一些副作用,缺乏抗腫瘤作用的特異選擇性。研究者近幾年致力于改變其結構以獲得效力更強、副作用更小的紫草素及萘醌衍生物,并取得一定的進展,如1C、3K、PMMB232等合成衍生物對HeLa細胞有更強的抑制效應[14,30,43]。此外,紫草素不溶于水,溶于乙醇、有機溶劑和植物油,給藥方式差異也會影響其效力,近年藥物化學和納米技術領域迅速發展,創造了基于紫草素的新型衍生物和納米制劑,使其藥理功能得到了改進。研究者用經典的成乳工藝制備紫草素微乳(SKN-MEs),再通過EDC/NHS縮合技術制備成CD133抗體修飾的紫草素微乳[44],能顯著抑制MDA-MB-231干細胞的成球性,異種移植實驗顯示其體內抑瘤率為78.5%,顯著高于紫草素組(31.3%)。

    目前,對紫草素抗腫瘤的研究多停留在分子水平,隨著全基因組測序、基因組編輯和定量蛋白質組學分析等新技術的出現,可以對紫草素抗癌功能的分子靶點和信號途徑有更徹底和更準確的認識,這些信息有助于開發紫草素或其衍生物作為有效的抗癌藥物,也需要更多的動物模型和臨床試驗以驗證紫草素用于臨床治療的有效性和安全性。

    參考文獻(略) 

    來  源: 陳  靜,侯  堯,伍春蓮.紫草素及其衍生物抗婦科腫瘤作用研究進展 [J]. 中草藥, 2020, 51(14):3814-3820.

     

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